დნმ-ს ეპიგენეტიკური სახესხვაობა - ეს არის მემკვიდრეობითი გენეტიკური სახესხვაობა, რომელიც გავლენას არ ახდენს მოლეკულის პირველად აგებულებაზე. დნმ-ს ყველაზე უფრო გავრცელებული ეპიგენეტიკური გარდაქმნაა მეთილირება. ნაჩვენები იყო, რომ დნმ-ს მოლეკულის გარკვეული უბნების შერჩევითი მეთილირების საშუალებით ხდება მრავალრიცხოვანი უჯრედული პროცესების მოწესრიგება:  

• ემბრიონის განვითარება;
• ქრომოსომული სტაბილურობა;
• ქრომატინის სტრუქტურული აგებულება;
• ტრანსკრიპცია;
• X-ქრომოსომის ინაქტივაცია.

დარღვეული მეთილირება შეიძლება გახდეს სხვადასხვა დაავადებების, მათ შორის კიბოს განვითარების მიზეზი.

კომპანია Applied Biosystems გთავაზობთ დნმ-ს მეთილირების ანალიზის სრულ კომპლექტს ოპტიმიზებული პროტოკოლით ანალიზის ყოველ საფეხურზე:

• ნაბიჯი 1: დნმ-ს გამოყოფა;
• ნაბიჯი 2: ბისულფიტური კონვერსია;
• ნაბიჯი 3: პრაიმერების შექმნა და გამრავლება;
• ნაბიჯი 4: თანმიმდევრობის განსაზღვრა;
• ნაბიჯი 5: მონაცემების ანალიზი.

ნაბიჯი 1: დნმ-ს გამოყოფა

დნმ-ს გაწმენდის ხარისხს გადამწყვეტი მნიშვნელობა აქვს ბისულფიტური კონვერსიის და შემდგომი პჯრ-ს წარმატებით ჩატარებისათვის. ცილების ბოლომდე მოსაშორებლად ანალიზის მომდევნო საფეხურის წინ უმჯობესია გამოვიყენოთ პროტეინაზა K. კომპანიები Applied Biosystems და Ambion გთავაზობენ სხვადასხვა კომპლექტებს დნმ-ს ხარისხიანად გამოყოფისათვის:

• RecoverALL™ Total Nucleic Acid Isolation Kit პარაფინირებული  ნიმუშებისთვის;
• MELT™ Total Nucleic Acid Isolation System ნიმუშების ჰომოგენიზაციიათვის;
• BloodPrep™ Chemistry System მთლიანი სისხლიდან, უჯრედების კულტურიდან ან პირის ღრუდან აღებული სინჯებიდან დნმ-ს გამოსაყოფად.

დიდი რაოდენობით ნიმუშების დასამზადებლად კომპანია Applied Biosystems გთავაზობთ 6100 Nucleic Acid PrepStation-ს - ნუკლეინის მჟავების გამოსაყოფ ნახევრად ავტომატურ სადგურს (96 ნიმუში 30 წუთში).

ნაბიჯი 2: ბისულფიტური კონვერსია

კომპანია Applied Biosystems-მა შეიმუშავა ბისულფიტური კონვერსიის ჩასატარებელი კომპლექტი methylSEQr™ Bisulfite Conversion Kit. დამუშავების საფეხურები:

• <300 ნგ დნმ-ს დენატურაცია methylSEQr™ კომპლექტის დენატურირებადი ბუფერით;
• რეაგენტი methylSEQr™ ბისულფიტით დამუშავებისთვის, ინკუბაცია სიბნელეში 15 საათის განმავლობაში 50°C ტემპერატურაზე;
• მიღებული პროდუქტის გაწმენდა methylSEQr™ კომპლექტის სვეტებზე ცენტრიფუგირებით.

რატომ უნდა დავამუშაოთ ბისულფიტით?

• ჩვეულებრივი პჯრ-ს დროს მეთილირების გამოვლენა შეუძლებელია;
• ბისულფიტით დამუშავების დროს არამეთილირებული ციტოზინი გარდაიქმნება ურაცილად, ხოლო მეთილირებული ციტოზინის აგებულება არ  იცვლება;
• თუ შემდეგ პჯრ-ს ჩავატარებთ, მაშინ ურაცილის ადგილზე მივიღებთ თიმინს, ხოლო 5-მეთილციტოზინის ადგილზე - ციტოზინს;
• ბისულფიტით დამუშავება ეპიგენეტიკურ სახესხვაობას გარდაქმნის გენეტიკურ ცვლილებად დნმ-ს პირველადი სტრუქტურის დონეზე, რომელიც შემდეგ შეიძლება გავაანალიზოთ პჯრ-ს საშუალებით.

სარგებელი გამოყენებით  methylSEQr™კომპლექტის გამოყენების უპირატესობები:

• დენატურაციის რბილი პირობები თავიდან გვაცილებს დნმ-ს ნაწილობრივ დანაწევრებას, მატულობს რეაქციით მიღებული მასალის რაოდენობა;
• ფისებით გაწმენდის სისტემებს გააჩნია მეთილირებული დნმ-სთან დიდი სიახლოვე.  ამის შედეგად მცირდება არამეთილირებული დნმ-ს გამოყოფა;
• ბიოსულფიტით დამუშავებული დნმ ინახება 4ºC ტემპერატურაზე 30 თვის განმავლობაში.

ნაბიჯი 3: პრაიმერების შექმნა და გამრავლება.

პრაიმერების შექმნა შეიძლება Applied Biosystems-ის მიერ შემუშავებული.  პროგრამული უზრუნველყოფით  Methyl Primer Express®. პროგრამის უფასოდ გადმოწერა შეიძლება შემდეგი ინტერნეტ მისამართიდან:

www.appliedbiosystems.com / methylprimerexpress

ნაბიჯი 4: თანმიმდევრობის განსაზღვრა

ნაბიჯი 5: მონაცემების ანალიზი

მიღებული თანმიმდევრობის შედარება რეფერენტულ თანმიმდევრობასთან პროგრამა SeqScape®-ის საშუალებით. რეფერენტული თანმიმდევრობა ბისულფიტით დამუშავების შეიძლება გადამოვიტანოთ პროგრამა Methyl Primer Express®-დან. CPG-კუნძულზე C-ები ყვითლად იქნება აღნიშნული. აგრეთვე შესაძლებელია მონაცემების გადატანა პროგრამა Genotype Report-ის საშუალებით.

სხვა პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენება:

CPG Viewer - გამოიყენება მეთილირების რუკების შესაქმნელად.

ინტერნეტ მისამართი: http://dna.leeds.ac.uk/cpgviewer/

BiQ analyzer გამოიყენება მხოლოდ ტექსტური თანმიმდევრობების ანალიზისათვის. პროგრამა იძლევა ანგარიშგებას მეთილირების შესახებ, აგრეთვე აფრთხილებს დაუსრულებელი მოქმედების შესახებ.

ინტერნეტ მისამართი: http://biq-analyzer.bioinf.mpi-inf.mpg.de     

დამატებითი ინფორმაცია მეთილირების შესახებ:

http://info.appliedbiosystems.com/methylation

ბიოსულფიტური თანმიმდევრობის სახელმძღვანელო:

http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/00116560.pdf

პროგრამული უზრუნველყოფის გადმოწერა:

http://appliedbiosystems.com/methylprimerexpress